流式︼细胞仪
流式细胞术简∮介
流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆№抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多◢参数、快速的定╱量分析。它可以高速分析上万个细胞,并能同→时从一个细胞中测得多个参数,具有速度快、精度高、准∏确性好的优点,是当代最先进的细胞定量分析技术之一。
细胞前处↙理(以流式周期实验为例)
-
收集细胞:弃去上清,加入1 ml PBS清洗一次,弃上清,再加入1 ml 0.25%胰酶消化〓细胞,待细胞变圆且有部分细胞悬浮,即加入PBS终止消化。用移液枪▲轻轻吹打细胞,使细胞悬浮。细↓胞悬液转入离心管中,1500 rpm离心5 min收集细胞。
-
PBS洗涤细胞:加入3 ml 4℃预冷的PBS完全重悬细胞,1500 rpm离心5 min,弃上清。沉淀震荡混匀々。
-
固定过夜:沉淀中缓慢加入-20℃预冷的75%乙醇,重悬细胞,4℃过夜。
-
PBS洗涤细胞:加入2 ml PBS混匀后,1500 rpm离心5 min收集细胞,PBS重悬,离心收集☉细胞。加入100 ul PBS重悬细胞。
-
去除RNA:加入2 μl 浓度为1 mg/ml 的RNaseA(去离子水配制),37℃水浴40 min。
-
荧光标记:加入100 μl浓度为100 μg/ml 的PI染色液(PBS配制),避光染色20 min。
-
上机检测:流式细胞仪使用◇激发波长488 nm,发射波长585±21 nm进行检测,用flowj软件分析细胞周期以确定细胞周期分布。
图1 图2
图1是细胞⌒凋亡测试,图2是细胞周期测试。
稳定细胞株构建∩
1.稳定细胞株构建介绍
构建稳定细胞系的基本原理是将★外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上,载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中,用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志Ψ物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用G418来代替【新霉素进行选择性筛选,筛选得到可稳定表达目的蛋白,或者稳定表达沉默特定基因「的细胞株。
2.技术路线图
【实验方法及▆流程】
1、目的细胞的合ω适抗生素浓度筛选;
2、目的细胞的合适病毒滴度筛选;
3、慢病毒构建与包装与滴度测定;
4、慢ω 病毒感染;
5、特定抗生素筛选稳转细胞株;
6、稳转细胞株鉴定。