流式细胞仪ξ
流式细胞术简介
流式细胞术工作原理是在细胞◥分子水平上通过单克≡隆抗体对单个细胞或其他生物粒子↘进行多参数、快速的定量分析。它可以》高速分析上万个细胞，并能№同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分╱析技术之一。
细胞前处♂理（以流式周期实验为例）
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收集细胞：弃去上清，加入1 ml PBS清洗一次，弃上清，再加入1 ml 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且『有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化。用〓移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。细胞悬液转入离心管中，1500 rpm离心5 min收集细胞。
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PBS洗涤细胞：加入3 ml 4℃预冷的PBS完〓全重悬细胞，1500 rpm离心5 min，弃上清。沉淀震荡混匀。
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固定过夜：沉淀中缓慢加入-20℃预冷的75％乙醇，重悬细胞，4℃过夜。
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PBS洗涤细胞：加入2 ml PBS混匀后，1500 rpm离心5 min收集细胞，PBS重悬，离心收集细胞。加入100 ul PBS重悬细胞。
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去除RNA：加入2 μl 浓度为1 mg/ml 的RNaseA（去离子水配制），37℃水浴40 min。
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荧光标记：加入100 μl浓度为100 μg/ml 的PI染色液（PBS配制），避光染色20 min。
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上机检测：流式细胞〒仪使用激发波长488 nm，发射波长585±21 nm进行检测，用flowj软件分析细胞周期以确定细胞周期分布。
图1 图2
图1是细卐胞凋亡测试，图2是细胞周期测试。
稳定细胞株构◆建
1.稳定细胞株构建介绍
构建稳定细胞系的基本原理是⌒将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主Ψ 细胞并整合到宿主染色体中，用载体中↓所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基◇因的细胞株。
2.技术路线图
【实验方︽法及流程】
1、目的细胞的合适抗生素浓度筛选；
2、目的∩细胞的合适病毒滴度筛选；
3、慢病毒构建与包装与滴度测定；
4、慢☆病毒感染；
5、特定抗生素筛选稳转细胞株；
6、稳转细胞株ζ鉴定。